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篇1

英文名稱：Microbiology

主管單位：中國科學院

主辦單位：中國科學院微生物研究所;中國微生物學會

出版周期：月刊

出版地址：北京市

語

種：中文

開

本：16開

國際刊號：0253-2654

國內(nèi)刊號：11-1996/Q

郵發(fā)代號：2-817

發(fā)行范圍：國內(nèi)外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時間：1974

期刊收錄：

CA 化學文摘(美)(2009)

中國科學引文數(shù)據(jù)庫(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2004)

中文核心期刊(2000)

中文核心期刊(1996)

中文核心期刊(1992)

期刊榮譽：

中科雙效期刊

聯(lián)系方式

期刊簡介

篇2

論文摘要：社會醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)應(yīng)成為醫(yī)療服務(wù)市場上的具有強大談判能力的第三方購買者，代表病人向醫(yī)療機構(gòu)購買服務(wù)，確保醫(yī)療服務(wù)的質(zhì)量與價格相匹配。由于種種原因，我國大學生醫(yī)療保險制度長期以來一直未能落實好這項職能。目前，國家正在開展把大學生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險的試點范圍，我們應(yīng)該以此為契機，理順關(guān)系，創(chuàng)造條件，充分利用醫(yī)療服務(wù)合同為大學生提供高質(zhì)量的醫(yī)療服務(wù)。

醫(yī)療服務(wù)合同是指由醫(yī)療保險機構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)簽訂的由醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)為特定的疾病患者提供醫(yī)療服務(wù)，并由醫(yī)療保險機構(gòu)支付醫(yī)療服務(wù)費用的合同。世界各國為有效地控制醫(yī)療費用，提高醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量，均采用了醫(yī)療服務(wù)合同的形式來明確醫(yī)療保險機構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)之間的權(quán)利義務(wù)。大學生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險后，應(yīng)充分利用醫(yī)療服務(wù)合同，明確醫(yī)患雙方的權(quán)利義務(wù)，為大學生提供價格合理、診治到位、服務(wù)高效的醫(yī)療服務(wù)。

一、大學生醫(yī)療服務(wù)合同的性質(zhì)界定

醫(yī)療保險體系的首要功能是為參保者提供醫(yī)療保障，確保他們不會因為支付困難而不去看病。醫(yī)療保險體系的另外一個重要功能，就是建立醫(yī)療服務(wù)的第三方購買者。當人們把醫(yī)療費用付給醫(yī)療保險機構(gòu)后，醫(yī)療保險機構(gòu)就形成了強大的購買力，成為醫(yī)療服務(wù)市場上的具有強大談判能力的購買者，它代表病人向醫(yī)療機構(gòu)購買服務(wù)，有能力運用各種手段來控制醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)的行為，確保醫(yī)療服務(wù)的質(zhì)量與價格相匹配。大學生醫(yī)療服務(wù)合同涉及參保方、醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)和醫(yī)療機構(gòu)三方關(guān)系，具有如下性質(zhì)特征：

1.大學生醫(yī)療服務(wù)合同是的為他人利益訂立的合同。在這—合同中，大學生只享受權(quán)利而不必承擔義務(wù)，合同的訂立無須事先通知或征得他們的同意。但自合同成立時起，他們就是債權(quán)人，享有獨立的權(quán)利，在醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)不履行合同時，可以直接針對醫(yī)療機構(gòu)行使所享受的權(quán)利。大學生可以接受醫(yī)療合同中為其設(shè)定的權(quán)利，也可以拒絕接受該權(quán)利，但不能變更合同規(guī)定的權(quán)利，合同的更改權(quán)由醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)行使。由于大學生無權(quán)參與合同的訂立和變更，為了確保合同訂立和變更能夠真正圍繞學生的利益而進行，并能有效地監(jiān)督和保證全面實際地履行，必須有一個主體集中代表大學生的利益，向經(jīng)辦機構(gòu)反映訴求并實施監(jiān)督權(quán)，高等學校對此具有不可推卸的責任。

2.大學生醫(yī)療服務(wù)合同是行政性合同。首先，醫(yī)療服務(wù)合同的一方當事人為醫(yī)療保險機構(gòu)，它是行政性的機構(gòu)或具有行政性的事業(yè)機構(gòu)，而它在訂立合同時也是以執(zhí)行行政性事務(wù)的名義與醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)簽訂合同。其次，醫(yī)療服務(wù)合同的內(nèi)容是為疾病患者提供特定的醫(yī)療服務(wù)，它具有社會公共利益的性質(zhì)。再次，在醫(yī)療服務(wù)合同的履行、變更或解除中，醫(yī)療保險機構(gòu)享有行政優(yōu)益權(quán)，即醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)享有單方面對合同履行監(jiān)督權(quán)，單方面強制履行權(quán)和單方面的合同解除權(quán)以及單方面的制裁權(quán)。最后，醫(yī)療服務(wù)合同爭議的處理只能依據(jù)行政程序進行，即通過行政復議和行政訴訟解決當事人之間的糾紛。

3.大學生醫(yī)療服務(wù)合同具有平等性和隸屬性。平等性體現(xiàn)在醫(yī)療保險機構(gòu)與醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)在簽訂合同時，醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)既可以同意與醫(yī)療保險機構(gòu)訂立合同，也可以不同意與醫(yī)療保險機構(gòu)訂立合同，并可就訂約內(nèi)容相互之間進行協(xié)商。但是合同一經(jīng)簽訂，合同當事人之間的關(guān)系便具有管理和被管理性質(zhì)。醫(yī)療保險機構(gòu)有權(quán)對醫(yī)療服務(wù)合同的執(zhí)行情況進行監(jiān)督檢查，并行使制裁權(quán)。因此，大學生醫(yī)療保險合同能否順利簽訂，簽訂之后能否完全實際履行，經(jīng)辦機構(gòu)起著至關(guān)重要的作用。

二、大學生醫(yī)療服務(wù)合同現(xiàn)狀及原因

我國大學生醫(yī)療保障制度一直未能很好地實現(xiàn)醫(yī)療服務(wù)第三方購買者的職能，保險經(jīng)辦機構(gòu)通過設(shè)定自付線、起付線、封頂線、可報銷藥品目錄等各種手段，對學生的就醫(yī)行為進行嚴格的控制，但是對服務(wù)提供者的行為卻近乎不聞不問。學生作為單個病人出現(xiàn)在醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)面前，處于明顯的弱勢地位，沒有能力要求醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)提供與其支付費用相匹配的醫(yī)療服務(wù)。究其原因，有如下幾點：

1.傳統(tǒng)大學生醫(yī)療費用報銷模式妨礙了醫(yī)療保險經(jīng)辦方談判權(quán)的行使。改革開放后的大學生醫(yī)療保險分為兩類，一是大學生公費醫(yī)療，二是由各高校自行組織學生參加的商業(yè)保險。不論是高校公費醫(yī)療的經(jīng)辦，還是商業(yè)保險公司費用的報銷，都是要求學生在就醫(yī)時必須支付全額醫(yī)療費用，然后再向?qū)W校和保險公司尋求報銷。在這種模式下，學校和商業(yè)保險公司處于被動狀態(tài)，無法有效行使醫(yī)療服務(wù)購買者的職能。

2.社會醫(yī)療保險機構(gòu)由于角色定位不當，未能行使購買者的權(quán)利。在市場經(jīng)濟環(huán)境下，經(jīng)辦機構(gòu)往往忽視了醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)在的盈利動機，在醫(yī)療保險的運作過程中，僅把參保者作為防范對象，沒有對醫(yī)療機構(gòu)進行有效的監(jiān)管。這突出表現(xiàn)在經(jīng)辦機構(gòu)長期以來只注重醫(yī)療保險費用需方控制而忽視供方控制這一現(xiàn)象上。因此，雖然目前社會醫(yī)療保險費用支付和補償已逐步由后付制向預(yù)付制過渡，經(jīng)辦機構(gòu)與醫(yī)療機構(gòu)對等談判的條件也開始形成，但如果經(jīng)辦機構(gòu)的觀念和角色定位不轉(zhuǎn)變，大學生納入城鎮(zhèn)居民基本醫(yī)療保險后，其購買者的權(quán)力仍然無法實現(xiàn)。

3.醫(yī)療服務(wù)市場發(fā)育不成熟，賣方市場沒有形成，經(jīng)辦機構(gòu)難以進行公平對等的談判。由于我國醫(yī)療機構(gòu)的分布和設(shè)置不能滿足國民對醫(yī)療服務(wù)的需求，因此吸收民間資本以充實和發(fā)展醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)成為我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展的大趨勢。但由于醫(yī)療機構(gòu)準入門檻過高，限制了民營資本的進入，目前在醫(yī)療服務(wù)市場發(fā)揮作用的，還是數(shù)量、條件都有限的公立醫(yī)院。由于市場發(fā)育不充分，沒有對公立醫(yī)院形成競爭壓力，市場機制不能發(fā)揮作用。在這種情況下，公立醫(yī)院處于獨家壟斷的地位，經(jīng)辦機構(gòu)沒有選擇和談判的余地，難以進行對等的談判。

三、充分發(fā)揮醫(yī)療服務(wù)合同的作用，為大學生提供公道合理的醫(yī)療服務(wù)

要在公正平等的基礎(chǔ)上訂立大學生醫(yī)療服務(wù)合同，必須理順醫(yī)療保險機構(gòu)和醫(yī)院以及保險機構(gòu)與學校的關(guān)系，在政府的參與下，推動大學生醫(yī)療費用的支付從公共報銷模式向公共契約模式的轉(zhuǎn)型。醫(yī)療保障機構(gòu)必須代表學生同醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)訂立契約，在契約中采取各種支付手段(如費用包干制、按人頭收費、按病種收費、按服務(wù)內(nèi)容收費等)的組合，來引導醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)在控制費用和維持質(zhì)量上保持平衡，為學生爭取最大權(quán)益。

1.健全完善醫(yī)療費用預(yù)付機制，為公共契約的訂立創(chuàng)造條件

預(yù)付制是訂立公共醫(yī)療服務(wù)契約的前提條件，醫(yī)療費用由醫(yī)保經(jīng)辦機構(gòu)直接向醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)提供，經(jīng)辦機構(gòu)便可以有效地行使其醫(yī)療服務(wù)購買者的職能，迫使醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)不斷提高醫(yī)療水平和保證服務(wù)質(zhì)量。隨著醫(yī)療保險費用支付和補償機制的不斷健全和完善，供方控制越來越受重視并日益加強對其監(jiān)控的力度，預(yù)付制正逐步取代傳統(tǒng)的后付制成為醫(yī)療保險費用的基本方式，訂立醫(yī)療服務(wù)合同的條件正在形成。目前這項工作的重點是要盡快理順醫(yī)保經(jīng)辦機構(gòu)與各級醫(yī)院(特別是初級醫(yī)院)的經(jīng)費預(yù)付關(guān)系，為經(jīng)辦機構(gòu)全面履行醫(yī)療服務(wù)購買職能創(chuàng)造條件。

2.加快醫(yī)療體制改革，發(fā)育完善醫(yī)療服務(wù)市場

市場機制作用的發(fā)揮，在于同行業(yè)之間形成競爭，優(yōu)勝劣汰，迫使每一經(jīng)濟實體不斷改進技術(shù)，提高服務(wù)質(zhì)量。從政策上來說，占我國各級醫(yī)療機構(gòu)絕大多數(shù)的公立醫(yī)院，既不是完全財政撥款的福利性單位，又不是以營利為目的經(jīng)濟實體。這種政策上的盲區(qū)致使它既沒有能力為國民提供醫(yī)療衛(wèi)生福利，又沒有擔心生存發(fā)展的危機。由于患者和醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)別無他選，只能接受由他們單方制定的各種條件，毫無討價還價之力。加大醫(yī)療體制力度，放低醫(yī)療領(lǐng)域準入門檻，鼓勵民間資本進入醫(yī)療領(lǐng)域，實行充分競爭，是克服上述問題的最好良方。通過競爭，讓醫(yī)療保險經(jīng)辦機構(gòu)有更多的選擇余地，讓那些條件苛刻，經(jīng)營無方，不能為患者提供等價優(yōu)質(zhì)服務(wù)的醫(yī)療單位失去訂單和市場，迫使他們改進和提高服務(wù)水平。

3.落實各方責任，切實把學生的利益發(fā)在第一位

篇3

【摘要】 為了研究兔骨髓間充質(zhì)干細胞(rBM-MSC)的生物學特征及其對不同生長因子的反應(yīng)，使用貼壁培養(yǎng)法從兔骨髓單個核細胞中獲得間充質(zhì)干細胞（MSC），在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察其基本生長行為和生物學特征；使用流式細胞儀檢測rBM-MSC的免疫學表型；RT-PCR法檢測其膠原表達；誘導rBM-MSC多向分化并使用特異性染色和RT-PCR予以鑒定；最后使用MTT法檢測IL-1、3、8和HGF對rBM-MSC生長增殖的影響。結(jié)果顯示：貼壁生長的rBM-MSC具有典型的成纖維樣細胞形態(tài)，可傳15代以上，第5代rBM-MSC高表達基質(zhì)受體CD44（32％），低表達造血細胞標記CD45（4.7％）；RT-PCR顯示高表達I型膠原，弱表達II型膠原，不表達X型膠原；在不同的誘導條件下，rBM-MSC 可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)元樣細胞。rBM-MSC對IL-3最為敏感，10 ng/ml的低濃度IL-3可顯著促進細胞增殖達32％以上（P

【關(guān)鍵詞】 骨髓； 間充質(zhì)干細胞；生長因子；兔

Biological Characteristics of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Response to Different Growth Factors

AbstractThis study was aimed to analyze the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (rBM-MSCs) and their response to different growth factors. Rabbit BM-MSCs were separated from bone marrow mononuclear cells by using adherent cultivation. Biological characteristics were investigated by optical and electron microscopy. Immunophenotype of rBM-MSCs was measured by flow cytometry. The expression of collagen was detected by RT-PCR. Differentiation potential was identified by specific staining and RT-PCR. The response of rBM-MSCs to IL-1， 3， 8 and HGF with different concentrations were tested by MTT. The results showed that the rBM-MSCs gave rise to a population of adherent cells characterized by the presence of a predominant cell type with a typical fibroblast-like morphology and could be cultured for over 15 passages. CD44 was highly expressed on F5 rBM-MSCs (32%) and CD45 was lowly expressed (4.7%). Type I collagen was highly expressed， while type II collagen was lowly expressed and type X collagen was not detected on rBM-MSCs using RT-PCR method. In various conditions inducting differentiation， rBM-MSCs could differentiate into the osteoblast， chondrocyte， adipocyte and neuron-like cells. The rBM-MSCs were sensitive to IL-3， even low concentration (10 ng/ml) of IL-3 could promote the proliferation of rBM-MSCs effectively (>32％， P

Key wordsbone marrow; mesenchymal stem cell; growth factor; rabbit

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell， BM-MSC）具有高度自我更新和多向分化的潛能，在不同的誘導條件下，可分化為多種組織細胞類型，如骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞［1］。目前對人和小鼠等物種的BM-MSC

已有深入研究，但對兔BM-MSC的生物學特性，尤其是其免疫學表型和對不同生長因子的反應(yīng)鮮有報道。兔的形體較大，便于進行移植和觀察，對兔BM-MSC的生物學特性進行深入的研究對實驗生物學具有重要意義。本研究采用貼壁培養(yǎng)法，在體外培養(yǎng)、擴增兔BM-MSC，對其形態(tài)特征、表面標記、多向分化功能以及對不同細胞因子的反應(yīng)進行初步研究，為以后的移植模型研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

實驗動物

3月齡雄性新西蘭大白兔6只，體重1.8± 0.2公斤/只，購自山東省農(nóng)科院兔場。

兔BM-MSC的分離培養(yǎng)

對兔按3％戊巴比妥鈉1 ml/kg體重行耳緣靜脈麻醉，無菌取股骨骨髓1 ml（肝素終濃度50 U/ml）。用淋巴細胞分離液（上海華精生物公司產(chǎn)品，相對密度1.077）獲得單個核細胞，以4×105/ml的密度懸浮于含10％小牛血清（杭州四季青產(chǎn)品）的高糖DMEM（Gibco/BRL公司產(chǎn)品）中，置100％濕度、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)72小時后全量換液，棄非貼壁細胞，每3天全量換液，約2周后貼壁細胞鋪滿80％瓶底， 用0.25％胰蛋白酶（Gibco/BRL公司產(chǎn)品）常規(guī)消化傳代。

電子顯微鏡觀察和細胞組織化學染色

取第5代BM-MSC進行掃描電子顯微鏡和透射電鏡觀察，并進行常規(guī)堿性磷酸酶染色（ALP）和糖原染色（PAS）。

免疫表型檢測

取第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，消化后用含0.1％ BSA的PBS懸浮，調(diào)整密度為1×106/ml，分別標記鼠抗兔CD44、鼠抗兔CD45和鼠抗MHC-I型分子抗體（IgG1，Serotec公司產(chǎn)品）10 μl，室溫放置30分鐘；另取1管作IgG同型對照；以緩沖液洗去未結(jié)合抗體，再加入200 μl FITC－羊抗鼠二抗（IgG，Beckman Coulter公司產(chǎn)品），避光孵育20分鐘，緩沖液洗去未結(jié)合抗體，流式細胞儀（CYTOMICSTMFC 500型，Beckman Coulter公司產(chǎn)品）檢測，結(jié)果用CYTOMETER 1.0軟件分析。

誘導分化及鑒定

成骨細胞取第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，約60％融合時加入成骨細胞誘導培養(yǎng)液（含10％小牛血清，地塞米松0.1 μmol/L，維生素C 0.2 mmol/L，β-甘油磷酸鈉50 mmol/L，Sigma公司產(chǎn)品），每3天全量換液1次，2周后行堿性磷酸酶染色和茜素紅S染色。

軟骨細胞取培養(yǎng)第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，約60％融合時加入軟骨細胞誘導培養(yǎng)液（含10％小牛血清，TGF-β1 3 ng/ml（PeproTech EC公司產(chǎn)品），地塞米松 0.1 μmol/L，β-甘油磷酸鈉 5 mmol/L，維生素C 0.2 mmol/L，胰島素 2 μg/ml，丙酮酸鈉 30 μg/ml，牛血清白蛋白 0.4 mg/ml，亞硒酸 2 μg/ml，亞油酸 2 μg/ml，Sigma公司產(chǎn)品），誘導2周后甲苯胺藍染色檢測膠原表達，RT-PCR檢測軟骨特異性Ⅱ型、Ⅹ型膠原和aggrecan基因表達。

脂肪細胞取第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，約90％融合時加入脂肪細胞誘導培養(yǎng)液（含10％小牛血清，胰島素6.25 μg/ml，地塞米松 0.1 μmol/L，IBMX 0.25 mmol/L，吲哚美辛 100 μmol/L（均為Sigma公司產(chǎn)品），2周后油紅O染色鑒定。

神經(jīng)細胞取第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，約90％融合時加入預(yù)誘導培養(yǎng)液（含10％小牛血清，bFGF 10 μg/L（PeproTech EC公司產(chǎn)品），48小時后加入神經(jīng)細胞誘導培養(yǎng)液（含10％小牛血清，1％ DMSO，BHA 50 μmol/L，Sigma公司產(chǎn)品），3天后RT-PCR檢測神經(jīng)細胞特異性nestin和NF-M基因表達，免疫組織化學鑒定神經(jīng)特異性抗原NSE的表達，一抗為鼠抗兔NSE，二抗為生物素化羊抗鼠IgG（武漢博士德生物公司產(chǎn)品）。

基因表達的RT-PCR檢測

細胞總RNA提取使用TRIzoL試劑 (Invitrogen公司產(chǎn)品)，反轉(zhuǎn)錄按照RT-PCR試劑盒（購于北京博大泰克生物公司）說明書操作。所得cDNA用于PCR擴增，引物見附表（上海博亞生物公司合成）:擴增程序為95℃ 30秒，65℃ 45秒，72℃ 45秒，5個循環(huán)；95℃ 30秒，60℃ 45秒，72℃ 45秒，20個循環(huán)；95℃ 30秒，55℃ 45秒，72℃ 45秒，4個循環(huán)；最后72℃ 延伸10 分鐘，PCR產(chǎn)物使用 2% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

不同細胞因子對兔BM-MSC增殖的影響

取第5代處于對數(shù)生長期的BM-MSC，以2 000個細胞/孔的密度培養(yǎng)于96孔板中，培養(yǎng)基為含10％小牛血清的高糖DMEM，分別加入不同濃度的IL-1、3、8和HGF（PeproTech EC公司產(chǎn)品），每組設(shè)12個復孔，培養(yǎng)48小時后常規(guī)MTT法檢測MSC對不同生長因子的增殖反應(yīng)，酶聯(lián)檢測儀(INTEC公司產(chǎn)品，Reader 2010型)檢測492 nm處吸光值。Table. Primer sequence（略）

統(tǒng)計學處理

計量數(shù)據(jù)用X+SD表示，組間差異分析用 t 檢驗， P

結(jié)果

細胞形態(tài)及特異性染色

兔骨髓單個核細胞在貼壁培養(yǎng)72小時后可見少量細胞貼壁，10天后BM-MSC能鋪滿80％瓶底，以成纖維樣細胞為主，HE染色可見核內(nèi)有2-4個明顯核仁（圖1A）；掃描電子顯微鏡下可見大部分細胞表面光滑（圖1B），少數(shù)梭形細胞有豐富的表面片狀皺褶；透射電子顯微鏡觀察顯示，膜光滑有少量微絨毛的成纖維樣細胞占大多數(shù)，該細胞核與細胞質(zhì)比約為1∶5，細胞核中常染色質(zhì)豐富、分布均勻，圖1C可見雙核仁，核仁大而結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體、線粒體、溶酶體和一些髓鞘樣小體，胞質(zhì)中分別有大量核糖體和微絲。BM-MSC細胞膜微絨毛較多，靠近這些突起的細胞質(zhì)中分布有致密的微絲，形成一條高電子密度帶（圖1D）。細胞化學染色2%-3％的細胞堿性磷酸酶陽性，在胞質(zhì)內(nèi)有紅棕色沉淀，陽性細胞在形態(tài)上與陰性細胞沒有差異（圖1E）；糖原染色全部細胞均為陽性，胞質(zhì)含大量紫紅色糖原顆粒（圖1F）。

誘導分化結(jié)果及其鑒定

加入成骨細胞誘導培養(yǎng)液2-3天后，細胞開始從長梭形縮短為多角形，細胞體積增大，誘導14天后茜素紅S染色為陽性，堿性磷酸酶陽性細胞大幅增加，表現(xiàn)出成骨細胞的特點（圖2A-C）；加入軟骨細胞誘導培養(yǎng)液后，細胞由長梭形顯著縮短為橢圓形，體積增大，甲苯胺藍染色呈陽性（圖2 D、E）。RT-PCR結(jié)果表明其表達軟骨細胞特異性的aggrecan基因，Ⅱ型膠原的基因表達也較誘導前增多，表現(xiàn)為軟骨細胞分化的特點；但Ⅹ型膠原不表達（圖2 I: 1-4）；成脂肪細胞誘導后細胞胞漿內(nèi)開始出現(xiàn)細小脂滴，細胞排列無序，顯微鏡下可觀察到高折光性的脂滴。油紅O染色顯示脂肪細胞內(nèi)大量的大顆粒狀脂滴（圖2F）；神經(jīng)預(yù)誘導劑加入后細胞形態(tài)變得細長，加入二次誘導劑后6小時內(nèi)約有60％的細胞死亡脫壁，剩余的細胞有50％表現(xiàn)為神經(jīng)元樣細胞特有的形態(tài)，伸出細長的偽足（圖2G，H）。這些細胞表現(xiàn)為NSE免疫組化染色陽性；RT-PCR結(jié)果顯示其表達神經(jīng)細胞特異性基因Nestin和NF-M（圖2 I: 5-6泳道）。

細胞表型及RT-PCR檢測

兔BM-MSC細胞上CD44抗原表達陽性率為32％；CD45表達陽性率為4.7％，MHC-Ⅰ型分子表達陽性率為1.8％；流式細胞儀測定結(jié)果見圖3A-D。RT-PCR顯示第5代的兔BM-MSC高表達Ⅰ型膠原，弱表達Ⅱ型膠原，不表達X型膠原、aggrecan、nestin和NF-M基因（圖3E）。

不同細胞因子對兔BM-MSC增殖的影響

酶聯(lián)檢測和MTT結(jié)果顯示，兔BM-MSC對IL-1、3、8和HGF的反應(yīng)模式基本相同，均為低濃度促進兔BM-MSC的增殖，高濃度反而抑制細胞生長，抑制效應(yīng)隨細胞因子濃度增加而增加；兔BM-MSC對IL-3的反應(yīng)最為明顯，10 ng/ml的IL-3可顯著促進細胞增殖達32％以上（P

討論

目前分離MSC的方法多基于其黏附貼壁和體外快速增殖能力，鑒定MSC則主要是根據(jù)其形態(tài)和功能。目前普遍認為BM-MSC表達CD13、CD29、CD44、CD59、CD105、CD166和HLA-ABC，不表達CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117和HLA-DR［2］。由于兔基因組計劃尚未完成，兔分化抗原的抗體難以得到，本實驗僅能選擇CD44和CD45。細胞黏附分子CD44屬于基質(zhì)受體（matrix receptor），是分布極為廣泛的細胞表面單鏈穿膜糖蛋白，在淋巴細胞、成纖維細胞和上皮細胞表面均能檢測到它的表達，專一性結(jié)合透明質(zhì)酸鹽并介導其內(nèi)吞，在細胞-細胞和細胞－基質(zhì)間作用中發(fā)揮重要作用［3］。我們的實驗結(jié)果顯示，約1/3的兔BM-MSC表達CD44，與獼猴BM-MSC的數(shù)據(jù)相同［4］，但較人BM-MSC的數(shù)據(jù)（>94％）為低［5］，這證明了物種間存在差異。我們培養(yǎng)得到的兔BM-MSC高表達I型膠原，弱表達Ⅱ型膠原，不表達Ⅹ型膠原和aggrecan基因。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分之一，目前已發(fā)現(xiàn) 19種膠原分子，I型膠原的分泌是MSC的標志之一，可有效地促進BM-MSC的黏附、增殖和分化［6］，有關(guān)報道證明，如將人BM-MSC向軟骨細胞方向誘導分化，則aggrecan基因、Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原的表達就會顯著增加［7］，我們的試驗結(jié)果顯示，將兔BM-MSC向軟骨細胞方向誘導分化后，表達aggrecan基因和Ⅱ型膠原，而不表達Ⅹ型膠原，這與人BM-MSC數(shù)據(jù)有差異。兔BM-MSC除向軟骨細胞分化以外，我們還成功地使其誘導分化為骨細胞、脂肪細胞和神經(jīng)元樣細胞，證明了其具有多向分化潛能。骨髓中BM-MSC的含量僅占1/106個有核細胞，并且隨著年齡的增加或體質(zhì)的衰弱，BM-MSC的數(shù)量逐漸減少［8］。因此要獲得足量的MSC，大量擴增純化是十分必要的。根據(jù)我們的實驗結(jié)果， 第5代之前的兔BM-MSC具有旺盛的增殖速度，倍增時間約為40小時，細胞形態(tài)狹長；從1 ml骨髓中獲得的BM-MSC傳代7-8次所得細胞數(shù)目可達5×108，已經(jīng)能夠足夠滿足體內(nèi)移植和一般實驗研究所需。隨著重復傳代，細胞變得寬大，生長速度下降，這和人BM-MSC中的研究結(jié)果相似，隨著BM-MSC的衰老，其對生長因子的反應(yīng)能力和多向分化能力也會顯著下降［9］。BM-MSC除表達IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15、 LIF、G-CSF、GM-CSF、M-SCF、FL 和SCF等多種細胞因子外，還能對bFGF、BMP、胰島素、TGF-β1和HGF等多種細胞因子作出增殖或分化響應(yīng)，證明其表達多種因子受體［11-13］。本實驗檢測了不同濃度的人IL-1、3、8和HGF對兔BM-MSC生長的影響。結(jié)果顯示，低濃度的人IL-1、3、8和HGF能促進兔BM-MSC的增殖，而高濃度則抑制其增殖，其中低濃度IL-3對兔BM-MSC的促增殖作用最為顯著，而高濃度的IL-3的抑制效果也較其他細胞因子明顯。BM-MSC本身不表達IL-1和IL-3［11，13］，IL-3主要由活化的T細胞產(chǎn)生， 而IL-3受體主要表達于造血細胞上并介導造血細胞的增殖、分化或激活。有文獻表明，人臍靜脈內(nèi)皮細胞也表達IL-3受體，并可被TNF或IFN上調(diào)?；旌螴L-3 和IFN可上調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細胞表達MHC II類分子并分泌IL-6和G-CSF等造血生長因子［14］。根據(jù)我們的結(jié)果，IL-3受體也表達于BM-MSC，IL-3可能通過IL-3受體促進BM-MSC的增殖并使其表達更多的造血生長因子?？傊狙芯砍晒Φ胤蛛x、培養(yǎng)了兔BM-MSC，檢測了其免疫表型和多向分化能力，與文獻報道的其他物種MSC的特性類似，并檢測了不同生長因子對其生長增殖的影響，為下一步應(yīng)用兔作為移植模型的研究奠定了基礎(chǔ)。

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篇4

資料與方法

實驗過程：于豬宰殺后30min內(nèi)清潔條件下取出心臟，經(jīng)過取瓣、修剪、滅菌培養(yǎng)等處理，制備20只主動脈瓣膜，分別隨機分成5組，通過程序性降溫，采用液氮冷凍（-196℃）保存，將瓣膜完全浸潤在凍存液中。分別經(jīng)過2周、4周、6周、8周、10周深低溫儲存后，解凍后測定不同儲存時限瓣膜生物力學指標。

檢測指標：生物學檢測指標主要有組織厚度，組織含水量，熱皺縮溫度；強度、組織伸長比。

統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)資料均以（χ±s）表示。采用SPSS 13.0、SAS 10.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗后，兩樣本均數(shù)采用組間或配對t檢驗，顯著性標準為P

結(jié)果

深低溫保存不同時限5組瓣膜厚度、組織熱皺縮溫度及組織含水量隨著保存時限延長呈逐漸遞增趨勢（f=8.238，p=0.074），但無統(tǒng)計學意義；破壞強度及伸長比各組間存在明顯差異，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異，見表1。

討論

由于目前臨床運用的人造心臟瓣膜

存在諸多的缺陷，機械瓣膜耐久性很好，但是術(shù)后抗凝的不當會引起出血和血栓的發(fā)生，組織工程瓣膜能很好地解決這一問題。最近研究表明其在細胞方面：不易黏附上去，膠原、彈力蛋白和蛋白聚糖等天然固有成分的缺失，力學性能較差。其主要原因為靜態(tài)環(huán)境下培養(yǎng)的瓣膜上的內(nèi)皮細胞黏附力低下，同時人體心臟瓣膜的結(jié)締組織具有復雜的結(jié)構(gòu)和分布形式，以耐受瓣葉起閉過程中不斷變化的應(yīng)力作用。以上研究提示生物瓣膜的細胞和纖維支架兩者都是造成瓣膜衰敗的重要因素。

同其他類型瓣膜相比同種瓣膜術(shù)后患者無須抗凝治療，廣泛應(yīng)用于瓣膜替換手術(shù)及嬰幼兒復雜先心病矯治術(shù)中。1962年Ross首次把人同種異體主動脈瓣應(yīng)用于臨床并取得成功，1986年O'Bfien首創(chuàng)了液氮超低溫冷凍保存技術(shù)，提高瓣膜耐久性，有效地減少了由人工瓣膜引起的心內(nèi)膜炎的發(fā)生率。其機制主要在于深低溫環(huán)境可中斷細胞的代謝，將損傷減到最小。同時，有文獻報告冷凍保存技術(shù)能抑制移植物內(nèi)皮細胞黏附因子的表達。因此目前如何提高同種瓣膜質(zhì)量與最適宜保存時限之間的關(guān)系受到學者們越來越多的重視。

活性同種瓣膜是指細胞或組織維持自身和與外界能進行正常交換的能力。而正常心臟瓣膜細胞成分又由內(nèi)皮細胞及間質(zhì)細胞構(gòu)成，內(nèi)皮細胞維持瓣膜表面的張力和通透性，抵抗血流沖擊導致的損傷等；而瓣膜間質(zhì)絀胞除了對瓣膜基質(zhì)的改建、重構(gòu)及對損傷的修復具有重要意義；細胞外基質(zhì)是生物力學性能的主要決定物質(zhì)，也提供了細胞黏附生長的正常結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境。

同時在實驗研究中發(fā)現(xiàn)瓣膜組織在程序降溫及深低溫保存后呈現(xiàn)一系列的變化，最早的改變是細胞固縮、水腫等現(xiàn)象。更嚴重的是細胞出現(xiàn)碎裂。整體看來，細胞結(jié)構(gòu)模糊。這樣變化解釋了該實驗中，通過檢測生物力學發(fā)現(xiàn)瓣膜組織在瓣膜厚度、組織熱皺縮溫度及組織含水量隨著保存時限延長呈逐漸遞增趨勢。生物力學性能中主要決定物質(zhì)的細胞外基質(zhì)在深低溫環(huán)境下受到不同程度的破壞，造成各實驗組隨著時間推移破壞強度及伸長比逐漸下降的結(jié)果，符合以前臨床和動物試驗的結(jié)果。

篇5

【摘要】

目的 探討Th1和Th2細胞因子表達譜研究在V型瘡性腎炎(VLN)患者中的作用。方法 分離血清，通過抗體芯片技術(shù)同時檢測4種Th1和5種Th2細胞因子表達譜，并探討其與臨床指標之間的相關(guān)性。結(jié)果 ①細胞因子表達譜：在同時檢測的9種細胞因子中，VLN患者有4種表達上調(diào)，除了IL2屬于Th1細胞因子外，其他三種(IL4、IL10和IL13)均屬于Th2細胞因子，其中IL10較健康對照升高了10倍以上。②相關(guān)性研究：Pearson相關(guān)分析顯示IL10與SLIEDAI呈正相關(guān)、與血紅蛋白濃度呈負相關(guān)；此外，IL4和IL13均與尿蛋白濃度呈負相關(guān)，IL1與血肌苷之間呈正相關(guān)。結(jié)論 VLN患者體內(nèi)細胞因子表達異常以Th2細胞因子為主，提示抗Th2細胞因子可能在V型狼瘡患者中具有一定的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 狼瘡性腎炎；細胞因子；免疫

ABSTRACT: Objective To study the effects of cytokines Th1 and Th2 in Class V lupus nephritis (VLN). Methods Serum concentration of Th1 cytokines (IFNγ， IL1， IL2 and TNFα) and Th2 cytokines (IL4， IL5， IL6， IL10 and IL13) were simultaneously analyzed using fast quant human Th1/Th2 protein array， and Pearson analysis was used to evaluate the association between cytokines and clinical parameters. Results ① Cytokine profiling: Among the 9 cytokines detected simultaneously by fast quant human Th1/Th2 protein array， the expression of four cytokines was upregulated obviously， namely， Th1 cytokines (IL2) and Th2 cytokines (IL4， IL10 and IL13); that of IL10 was 10 times above the normal control. ② Pearson correlation analysis: There was a positive correlation between IL10 and SLEDAI (r=0.877， P

KEY WORDS: lupus nephritis; cytokine; immunity

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE) 是一種T細胞介導的、自身反應(yīng)性B細胞高度增生、大量高親和力的致病性的自身抗體產(chǎn)生的自身免疫性疾病[1]。狼瘡性腎炎(lupus nephritis， LN)是SLE患者較常見的最嚴重的并發(fā)癥和死亡的主要原因之一[2]。LN患者病程反復，伴有進展性的組織病變，疾病的死亡率居高不下，目前主要是通過應(yīng)用非特異性免疫抑制劑和進行抗炎治療。如果能了解SLE導致腎損傷的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新型的低毒性治療方法，會更好的進行特異性的治療，改善狼瘡性腎炎患者的預(yù)后。

伴隨著免疫細胞的數(shù)量和功能上的異常，細胞因子網(wǎng)絡(luò)的變化對LN病程的演進有重要的作用：Th1型和Th2型細胞因子比例失調(diào)、細胞因子水平分泌增加或減少、細胞因子間相互的拮抗或協(xié)同作用增強或減弱等都參與了LN的發(fā)病過程[3]。但是，LN屬于一種以腎臟形態(tài)學異常為基礎(chǔ)的臨床綜合征，而且LN發(fā)病機制十分復雜，同一個患者可以同時存在多種細胞因子的異常，不能孤立的看待某一種細胞因子的異常，而多種細胞因子間的相互作用可能更為重要。因此，本實驗以V型LN患者為基礎(chǔ)，通過系統(tǒng)生物學的研究方法，借助高通量的抗體芯片技術(shù)同時觀察V型LN患者血清多種細胞因子(包括Th1細胞因子和Th2細胞因子)的變化，以期從免疫學網(wǎng)絡(luò)失衡角度闡明LN可能的發(fā)病機制，為治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

按照1982年美國風濕病協(xié)會SLE的診斷標準[4]選擇狼瘡性腎炎患者20例，均為女性，具有腎臟累及的臨床表現(xiàn)；均進行腎活檢。根據(jù)1985年WHO改良病理分型標準進行分型診斷符合彌漫膜性腎炎(V型)，根據(jù)SLEDAI評分(SLE Disease Activity Index)標準判斷LN患者腎活檢時疾病活動情況[5]，所有患者3月內(nèi)未使用霉酚酸酯(MMF)或環(huán)磷酰胺(CTX)等強免疫抑制劑治療。同時選擇年齡和性別匹配的健康志愿者20例作為正常對照。

1.2 血清細胞因子檢測

清晨抽取空腹靜脈血5mL，離心后留取血清，-70℃保存待測。血清細胞因子的檢測采用德國Whatman公司提供的抗體芯片，同時定量檢測9種細胞因子的表達，其中包括4種Th1細胞因子IL1(白細胞介素1)、IL2(白細胞介素2)、IFNγ(γ干擾素)、TNFα(腫瘤壞死因子α)和5種Th2細胞因子IL4(白細胞介素4)、IL5(白細胞介素5)、IL6(白細胞介素6)、IL10(白細胞介素10)、IL13(白細胞介素13)的表達。每個因子檢測設(shè)立3個復孔，取平均值。具體操作簡述如下：玻片裝上孵育室并將玻片/孵育室一起裝入玻片夾；70μL封閉液室溫封閉15min；常溫孵育樣品過夜(輕微振蕩)；洗滌5次；生物素標記的抗體室溫孵育60min(輕微振蕩)；洗滌5次；StreptavidinCy5室溫孵育45min(輕微振蕩)；洗滌5次；DiH2O沖洗玻片并干燥；掃描玻片，進行資料分析。

1.3 其他實驗室檢查

所有患者同時進行以下檢查：①24h尿蛋白定量：采用雙縮脲比色法，正常值＜0.4g/24h；②自身抗體：抗核抗體(ANA)采用間接免疫熒光法，抗雙鏈DNA(dsDNA)采用短膜蟲法；③補體C3、C4：采用散射比濁法。

1.4 統(tǒng)計學方法

結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。組間差異采用Students t檢驗，并通過Pearson相關(guān)性分析研究細胞因子表達及淋巴細胞亞群與臨床指標之間的相關(guān)性。以P

2 結(jié) 果

2.1 患者的臨床實驗室的相關(guān)檢查

V型LN患者一般臨床資料見表1。V型LN患者白細胞、血紅蛋白、補體C3和C4均明顯低于健康對照組。與健康對照相比，白細胞計數(shù)分別為(5.015±1.426)×109/L和(6.271±2.730)×109/L(P

2.2 血清細胞因子的表達譜

V型LN患者所檢測的9種細胞因子中有4種較對照組升高，除IL2屬Th1細胞因子外(P

為明確細胞因子增長情況，我們以健康對照組細胞因子平均值為基數(shù)，觀察了每種細胞因子增長幅度，發(fā)現(xiàn)V型LN患者升高最明顯的細胞因子是IL10，較對照組升高了10倍以上，其他幾種細胞因子增高幅度均在3～5倍之間，提示在LN中存在明顯的細胞因子的比例失衡，細胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的平衡被打破，表現(xiàn)為細胞因子上調(diào)幅度不均一。表2 V型狼瘡性腎炎和健康對照組Th1、Th2細胞因子濃度的變化（略）

2.3 相關(guān)性研究

Pearson相關(guān)分析顯示，主要是Th2細胞因子與臨床表現(xiàn)之間存在明顯的相關(guān)性，尤其是IL10，如IL10與SLIEDAI呈正相關(guān)(r=0.877，P

3 討 論

LN是我國最常見的繼發(fā)性腎小球腎炎，其臨床和腎臟病理改變存在顯著的不均一性和多樣性，不同的病理類型不僅反應(yīng)了形態(tài)學上的差異，更可能蘊含不同的發(fā)病機制。V型病變表現(xiàn)為膜性病變，以上皮側(cè)免疫復合物沉積和補體沉積為主要特征，臨床上以大量蛋白尿為突出表現(xiàn)，但其發(fā)病機制尚未完全闡明。

如前所述，細胞因子參與免疫反應(yīng)的每一個環(huán)節(jié)。細胞因子網(wǎng)絡(luò)中，Th1/Th2細胞因子的失衡尤為受到研究者的關(guān)注，目前有Th2優(yōu)勢、Th1優(yōu)勢以及Th1向Th2轉(zhuǎn)化發(fā)展的優(yōu)勢等[6]不同的假說。但是，Th1/Th2各代表了一組細胞因子，如果能同時檢測多種細胞因子表達，將對研究細胞因子失衡在LN中的作用具有重要意義?？贵w芯片可以一次性的檢測上百上千種蛋白質(zhì)的表達豐度，具有特異性強，敏感性高，檢測范圍廣等優(yōu)勢。因此，本實驗采用系統(tǒng)生物學的研究方法，通過高通量的抗體芯片技術(shù)對V型LN患者體內(nèi)9種細胞因子(包括Th1和Th2細胞因子)同時進行分析，以便全面了解V型LN患者體內(nèi)細胞因子的表達情況。

本實驗首先對細胞因子表達進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)所檢測的9種細胞因子有4種明顯升高，包括一種Th1細胞因子和3種Th2細胞因子。但是，增長幅度顯著不同，以Th2細胞因子增長最明顯，其中IL10增加最顯著，較健康對照組升高10倍以上，提示VLN患者體內(nèi)細胞因子表達平衡被打破。作為Th2細胞因子的代表， IL10 在SLE 體液免疫激活和自身抗體產(chǎn)生中有不可忽視的促進作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL10基因多態(tài)性不僅與LN 全身活動性相關(guān)，還對腎臟的臨床活動和免疫病理損害產(chǎn)生影響[7]。自身抗體的產(chǎn)生是SLE發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素，與其相應(yīng)的自身成分結(jié)合成循環(huán)免疫復合物在機體各處沉積，激活補體系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成廣泛的組織損傷[89]。作為B細胞活化和增殖的促進因子，IL10血清水平的升高恰好可以解釋LN患者免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)。

目前，關(guān)于細胞因子與LN疾病的相關(guān)性研究主要集中于細胞因子與狼瘡疾病活動性指數(shù)、自身抗體之間的相關(guān)性上。但是，在此方面卻存在較大爭議。例如，RAPLEY等報道IL6水平與SLE活動性相關(guān)[10]，WAIS卻認為IL6與SLE活動性無相關(guān)性[11]；作為一種Th1細胞因子，IFNγ在SLE發(fā)病機制中具有重要作用[12]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)VLN型患者體內(nèi)IFNγ無明顯改變，考慮與患者入選標準不同、細胞因子檢測方法不同有關(guān)。本實驗中發(fā)現(xiàn)主要是Th2細胞因子與臨床表現(xiàn)之間存在相關(guān)性。例如，IL10與SLEDAI呈正相關(guān)，與血紅蛋白濃度呈負相關(guān)；IL4和IL13均與尿蛋白濃度呈負相關(guān)，提示Th2細胞因子可能參與腎臟疾病進展。但是，本研究主要選擇未經(jīng)過強免疫抑制劑治療的患者，如果能增加部分活動性相對較弱的病例，或?qū)θ脒x患者進行免疫抑制劑治療后做縱向?qū)Ρ确治觯赡軙峁└幸饬x的數(shù)據(jù)，可通過治療前后細胞因子的變化判斷LN治療的效果，即細胞因子可能成為判斷LN病情及治療效果的生物學標記物。

狼瘡性腎炎是發(fā)病機制復雜的異質(zhì)性疾病，不僅淋巴細胞參與其中[13]，復雜的細胞因子免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，及其受體間平衡紊亂也可能參與狼瘡性腎炎的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)V型狼瘡性腎炎患者體內(nèi)存在廣泛的淋巴細胞異常及細胞因子表達譜異常，提示顯著的免疫功能紊亂。這可能是目前免疫抑制劑治療狼瘡性腎炎的基礎(chǔ)。但是，本課題僅限于未經(jīng)強免疫抑制劑治療的患者，如果能增加部分治療后的隨訪觀察結(jié)果，可能會對狼瘡性腎炎的免疫學發(fā)病機制及免疫抑制劑的治療機制提供進一步的理論基礎(chǔ)。

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篇6

關(guān)鍵詞：微生物學習；細菌分類；方法

中圖分類號：G642 文獻標識碼：B 文章編號：1002-7661（2015）16-006-02

簡單地說，微生物就是我們?nèi)祟愑萌庋酆茈y將其觀測到的細微生物。細菌是微生物中的一類，屬于原核生物，按照形態(tài)可以分為球菌、桿菌以及螺旋菌。細菌雖然微小，但是其分布極為廣泛，在人體中，細菌的數(shù)量要遠遠超過人體細胞的總量，其重要性由此可見。

一、關(guān)于微生物學的學習

在生物專業(yè)學習中，微生物學是其重要分支之一，可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)（例如釀酒、酸奶制作等）、醫(yī)藥（例如醫(yī)學中細菌病毒檢測、藥品中各種菌素片等）、生物工程以及細胞工程等等。由于微生物是我們?nèi)庋劭床灰娀蛘呖床磺宓募毼⑸?，所以如果沒有顯微鏡，認識起微生物來就不夠直觀，這也導致了人類歷史中很長一段時間雖然有很多利用微生物的事件被記載，但都沒有意識到微生物的存在。所以在學習微生物學的過程中，要注重學生自己親身觀察實踐，利用顯微鏡等儀器，將微生物直觀地展示在學生眼前。

當然在現(xiàn)代社會，絕大部分學生對微生物已經(jīng)不陌生，但是在沒有學習微生物學之前真正對其了解并喜愛的可能不多，在微生物學習過程中，還要注重學生學習興趣的培養(yǎng)，在學習之初，要通過微生物與人類息息相關(guān)的實例以及多媒體教學的視覺沖擊吸引學生的注意力，然后通過提出與生活有關(guān)的問題引發(fā)學生的思考，讓其對微生物學產(chǎn)生好奇，然后利用顯微境等儀器引導學生解答問題，激起學生成就感，從而引發(fā)其興趣。

二、微生物學習中細菌分類概述

在微生物學習中，《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》以及《伯杰氏細菌鑒定手冊》是細菌分類以及細菌鑒定的權(quán)威以及代表作品，由于生物技術(shù)在不斷進步，所以這兩部手冊也在不斷修訂。

目前，對細菌種類的研究主要是在細菌分類基礎(chǔ)上，對細菌菌株進行鑒定；以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究細菌進化關(guān)系；也有在同一屬的細菌范疇內(nèi)對細菌的種進行分群聚類研究。這些研究都是以細菌分類為基礎(chǔ)，從中也可以看出在微生物學習中細菌分類的重要性。

在學習細菌分類的過程中，要注意細菌分類是不斷進步不斷更新的，這主要是由于生物技術(shù)不斷推陳出新、研究細菌分類的方法就在不斷進步。同時還要注意技術(shù)的更新?lián)Q代是一個連續(xù)的過程，新技術(shù)是在原有技術(shù)的基礎(chǔ)上不斷探索發(fā)明的，所以要注意不要因為有了新技術(shù)，就將原有的完全拋棄，也許在研究過程中可以只使用新技術(shù)，但是在學習時，也應(yīng)該對歷史有所了解和認識。所以學習細菌分類時，應(yīng)該全面、連貫。

三、微生物學習中細菌分類方法探討

對細菌進行分類，方法非常重要。所以，在微生物學習中，細菌分類方法具有重要地位。目前，細菌分類的方法主要包括特征分類法、數(shù)值分類法、組分分類法、分子生物學分類法以及多相分類法等。

1、特征分類法

不同的細菌，其形態(tài)、代謝以及生存環(huán)境存在一定差異，在生物技術(shù)不發(fā)達的年代，人們依據(jù)形態(tài)、生理以及生存環(huán)境等基本特征對細菌進行分類。不過由于細菌體積微小，使得這些特征的觀察較為籠統(tǒng)，所以這種分類方法比較粗獷，很難對細菌進行進一步區(qū)分。特征分類法是一種古老、相對較為宏觀的分類方法。

2、數(shù)值分類法

隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，數(shù)值分類法開始大規(guī)模興起。細菌的表性特征有很多，將這些特征全部進行檢測，然后利用計算機技術(shù)對這些特征進行歸納分類，這就是數(shù)值分類法。相對特征分類法，數(shù)值分類法要精細一些，但是其需要測定的特征很多。由于數(shù)值分類法能夠定量反應(yīng)細菌特征，所以目前該方法應(yīng)用依然較為廣泛。

3、組分分類法

組分分類法主要利用質(zhì)譜、光譜、氣相色譜以及高效液相色譜等技術(shù)檢測細菌的化學組分。需要檢測的細菌化學組分主要來源于細胞壁、細胞膜脂肪酸、枝菌酸、磷脂、醌、以及蛋白質(zhì)等。檢測細胞壁主要是檢測其氨基酸和糖分；脂肪酸和枝菌酸都是細胞膜的重要組成成分；磷脂是極性脂；醌是非極性脂，存在于線體膜以及細胞質(zhì)膜；蛋白質(zhì)組分檢測是采用全細胞蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)。

4、分子生物學分類法

分子生物學分類法主要包括16S rRNA基因等序列分析、GC含量分析、DNA指紋技術(shù)、ITS序列分析、DNA-RNA雜交技術(shù)以及DNA-DNA雜交技術(shù)。目前，該方法應(yīng)用廣泛，用于細菌分類、多樣性分析的基因除了16S rRNA基因外，還有16S～23SrRNA基因、tuf基因、hsp60基因、pheS基因等。當然，16S rRNA基因在利用基因序列分析進行細菌分類研究中應(yīng)用最為廣泛。

5、多相分類法

多相分類法就是綜合上述幾種方法進行細菌分類，該方法是一種綜合的方法，將幾種單一方法結(jié)合起來，互相驗證、補充，可以得到更為合理可信的結(jié)論。

四、結(jié)束語

微生物學習中，細菌分類是一項系統(tǒng)但又繁瑣的工作，而且細菌分布廣泛、變異快，新種不斷被發(fā)現(xiàn)，將新種進行鑒定和分類應(yīng)該采用多種方法，而不能簡單的通過單一方法就下結(jié)論，多相分類法就是用多種單一方法進行分類鑒定，所以相對更為全面可靠。

參考文獻

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篇7

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；聚γ-谷氨酸；硝酸鈉；補料發(fā)酵；生物量

中圖分類號：TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）04-0903-04

Optimizing Sodium Nitrate Fed-batch Culture on Poly（γ-glutamic acid） Fermentation by Bacillus licheniformis WX-02

XU Shang-hua，HU Li-fang，CHEN Shou-wen

（Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430070，China）

Abstract： Bacillus licheniformis WX-02 was used to study the ways of improving poly（γ-glutamic acid）（γ-PGA） yield. The optimal conditions of sodium nitrate feeding for γ-PGA fermentation by Bacillus licheniformis WX-02 by flask-shaking fed-batch fermentation were the initial sodium nitrate concentration 10 g/L， and 5 g/L of sodium nitrate added when fermentation to 12 h. The fermentation was carried out in a 3 L fermentor， showing that the maximum of biomass and γ-PGA yield was 4.5 g/L and 38.7 g/L with increase of 55.2% and 14.8%， compared with the control. It is indicated that adding sodium nitrate can increase biomass， enhance the utilization of glutamate， and improve the γ-PGA fermentation.

Key words： Bacillus licheniformis； poly-gamma-glutamic acid； sodium nitrate； feeding fermentation； biomass

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 地衣芽孢桿菌WX-02，由華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室篩選和保藏，保藏號為CCTCC M208065。

1.2 方法

參考文獻：

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篇8

英文名稱：Bulletin of Science and Technology

主管單位：浙江省科技技術(shù)協(xié)會

主辦單位：浙江省科學技術(shù)協(xié)會

出版周期：雙月刊

出版地址：浙江省杭州市

語

種：中文

開

本：大16開

國際刊號：1001-7119

國內(nèi)刊號：33-1079/N

郵發(fā)代號：32-95

發(fā)行范圍：國內(nèi)外統(tǒng)一發(fā)行

創(chuàng)刊時間：1985

期刊收錄：

中國科學引文數(shù)據(jù)庫(CSCD―2008)

核心期刊：

中文核心期刊(2008)

中文核心期刊(2000)

期刊榮譽：

Caj-cd規(guī)范獲獎期刊

聯(lián)系方式

期刊簡介

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關(guān)鍵詞：PCR；農(nóng)業(yè)技術(shù)；發(fā)展簡史；基本原理

中圖分類號： Q555 文獻標識碼：A

在生物學領(lǐng)域中，聚合酶鏈式反應(yīng)作為體外擴增基因序列的生物技術(shù)占有很重要的位置，并且與分子克隆技術(shù)和DNA序列分析方法構(gòu)成了分子生物學實驗工作和學習的基礎(chǔ)。PCR技術(shù)的發(fā)明成為了生物界的里程碑并且是分子生物學的一項偉大的革命，它隨之帶來的是分子生物學以及生物技術(shù)在工業(yè)和產(chǎn)業(yè)的推進和發(fā)展[1]。

1 PCR技術(shù)發(fā)展簡史

1971年Khorana最早提出了一個大膽的設(shè)想，那就是核酸體外擴增。但是，當時對于基因的排序和測序分析方法并不成熟，還沒有發(fā)現(xiàn)對熱定性的DNA聚合酶，所以這個想法沒有任何實際意義的[2]。1985年美國的Kary Mullis受到高速公路的啟發(fā)，在科學Science雜志上發(fā)表了PCR技術(shù)學術(shù)論文。20世紀80年代初，美國科學家Keohanog通過對實驗室中所使用的酶的改進，大大提高了擴增的可實行性[3-5]。在之后的幾十年里，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為十幾種研究領(lǐng)域。

2常用的PCR技術(shù)

2.1 原位PCR

原位PCR是在組織切片或組織細胞里進行的PCR反應(yīng)，它具有高度特異敏感和細胞定位能力，可以在細胞和分子水平上檢測轉(zhuǎn)特定的基因序列 [2]。

2.2 不對稱PCR

不對稱PCR是在PCR反應(yīng)過程中采用兩種不同濃度的寡核苷酸引物，經(jīng)過若干輪采用循環(huán)后，待低濃度的引物被消耗盡，隨后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度的產(chǎn)物既延伸產(chǎn)物，結(jié)果產(chǎn)生了大量的特異單鏈DNA[2]。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄—PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR是以反轉(zhuǎn)錄DNA即cDNA作為模板進行PCR反應(yīng)，能夠使mRNA呈現(xiàn)多態(tài)性并且利用基因表達測定的強度和鑒定已被轉(zhuǎn)錄的序列是否發(fā)生突變，主要克隆mRNA的3’和5’的末端序列，以及可以從非常少量的信使RNA樣品中構(gòu)建cDNA文庫[5]?？梢允狗治鲆恍O為微量的RNA樣品變?yōu)榭赡躘6-8]。

2.4 反向PCR

PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應(yīng)體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。

2.5 多重PCR

多重PCR在同一個PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入了兩對或兩對以上的寡核苷酸引物，并且同時能擴增出數(shù)量較多的核酸片段的PCR，其反應(yīng)原理和操作過程一般與其他PCR相同[4-7]。

2.6巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對PCR引物擴增完整的片段。第1對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第2對引物稱為巢式引物結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第2次PCR擴增片段短于第1次擴增 。

2.7錨定PCR

用于擴增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進行PCR擴增[8]。

2.8重組PCR

重組PCR就是使兩個不相鄰的基因片段重組在一起的PCR。但是重組PCR所重組的基因片段長度都在1kb左右，因此在長片段的重組技術(shù)和提高準確度來說目前還有比較大的難度。

2.9定量PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標準，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量。目前，主要采用定量的PCR方法主要包括設(shè)立內(nèi)參照物的定量PCR、極限稀釋法、熒光定量PCR、FQ-PCR、定時定量PCR等。

2.10 熱不對稱性PCR

熱不對稱性PCR是以基因組的DNA作為模板，并且利用依照目標的序列已知序列設(shè)計出3個具有較高退火溫度的嵌套特異性引物，和一個長度較為短Tm值的隨機簡并引物進行組合，通過3輪具有熱不對稱的溫度循環(huán)進行分級和擴增PCR，并且在獲得已知序列的側(cè)翼序列后用3個嵌套特異性引物分別與簡并引物組合來進行PCR反應(yīng)。

3 結(jié)論

PCR技術(shù)是一種極為重要的分子生物學研究的基礎(chǔ)技術(shù)，還可以成為基因工程來提供目的基因，并且廣泛地應(yīng)用在親自鑒定、個體識別、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物科學的各個領(lǐng)域。

參考文獻

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篇10

關(guān)鍵詞：生物；教學技巧；語言點撥

中圖分類號：G632 文獻標識碼：A 文章編號：1002-7661（2012）21-144-01

點撥教學法是教學中的一種重要的教學技巧，隨著時代的進步，點撥法有了新的發(fā)展中的內(nèi)容和要求，語言點撥作為一種傳統(tǒng)的教學技巧，在新的教學要求下也要與時俱進：在現(xiàn)代教育科學思想理論的指導下，貫徹啟發(fā)式教學原則，靈活綜合運用各種具體教學方法的一種現(xiàn)代化和科學化的教學，是貫徹素質(zhì)教育、提高學生能力的有效方法。

生物課程是一門基礎(chǔ)性的實驗性的學科，對培養(yǎng)學生的能力有著天然的優(yōu)勢，在生物課程中，點撥是一種重要的教學技巧，對培養(yǎng)學生的綜合能力有著不可取代的作用。

語言點撥是指在學生學習的過程中，思維或語言產(chǎn)生障礙時，教師借助精練恰當?shù)恼Z言進行點撥，幫助學生突破障礙，使思維進程加快，語言表達流暢。有以下幾種點撥方法：

一、輔助點撥 當學生的思維活動因智力水平或努力程度不夠等原因，在解決難度較大的問題顯得力不從心時，就需要教師助一臂之力。例如，當講完“爬行類”時，教師若直接讓學生回答“為什么青蛙和鱉都能生活在水中，又能生活在潮濕的陸地，但它們卻不屬同類生物”這一問題時，不少學生有一定困難。這時教師可設(shè)計幾個帶有啟發(fā)性的階梯問題進行點撥：二者的呼吸方式有何不同？二者的皮膚有何不同？二者的生殖和發(fā)育有何不同？這樣學生便可由表及里地抓住事物本質(zhì)，解決學習中的疑點、難點，形成良好的認知結(jié)構(gòu)。

二、旁敲側(cè)擊 它是指教師不直接點明思路，而是間接的、暗示的、曲折的進行點撥，或言在此意在彼的啟發(fā)；或旁敲側(cè)擊的暗示；或迂回曲折的誘導；或在問題的峰回路轉(zhuǎn)處巧設(shè)標志，使其洞天疊出、曲徑通幽；或讓學生從舊知孕育出新知的生長點；或讓學生在解決問題時找到與之有聯(lián)系的相似點、相關(guān)點，受到啟發(fā)，展開聯(lián)想，產(chǎn)生靈感，找到解決問題的最佳途徑。例如講“血液循環(huán)”時，讓學生回答“左心房連接的血管是動脈血管還是靜脈血管？其中流動的是動脈血，還是靜脈血”這一問題，當學生答不上來時，教師可采用從旁點撥的方式進行啟發(fā)：“和左心房相連的血管的血液流向何處？它的另一端連接的是什么器官？這個器官的作用是什么？”這樣學生便會茅塞頓開，不僅知其然，而且知其所以然，加深了對問題的理解。

三、一語破的 教師在教學中采用直截了當、開門見山、一語破的的點撥方法。例如學生有時解答問題，盡管心中清楚，但由于對個別詞語的遺忘，或表述水平有限，一時難以找到恰當?shù)脑~語來表述，導致“水壺裝餃子倒不出來”的情景，這時教師可直接給學生提供詞語，幫助其越過語言障礙，得到答案。

四、軸輻點撥 任何一個學生難于理解的知識點都有其關(guān)鍵點，這個關(guān)鍵點與相關(guān)的知識點就像古代車輪的軸與輻的關(guān)系，教師以某一教學內(nèi)容為中心進而引發(fā)出與之相關(guān)或相同的教學內(nèi)容就是軸輻點撥。如在引導學生閱讀“遺傳工程”這段短文時，可抓住克隆技術(shù)這個概念，由點到面地進行點撥：克隆技術(shù)可消除遺傳疾??；可制造人的各種器官；可使滅絕的生物復活；動植物可實施車間化生產(chǎn)等等。使學生具有擴散性、廣闊性、靈活性。

五、向心聚點 它是與軸輻點撥相反的一種點撥方法，是教師為集中解決某一問題由點到面、由此及彼進行點撥。例如講“生物進化的規(guī)律”時，教師可點出魚類、兩棲類、爬行類、哺乳類的生活習性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征的異同，學生會不難發(fā)現(xiàn)生物的進化規(guī)律是：由水生到陸生，由簡單到復雜，由低等到高等，從而總結(jié)出規(guī)律性的東西，加深對問題的理解，使其思維具有深刻性。

上面所談，只是教學實踐中的幾個舉例，而不是語言點撥內(nèi)容與方式的齊全羅列。我只能說，像這些做法就是點撥，而不能說，點撥法僅限于此。一言以蔽之，生物教學過程中的語言點撥法，應(yīng)根據(jù)具體內(nèi)容選擇適當?shù)狞c撥方法，“當點則點，當撥則撥”，做到瀟灑自如，游刃有余，從而顯示出高超的點撥藝術(shù)的魅力。只有這樣，才能真正地發(fā)揮好教師的主導作用和學生的主體作用。

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